Neuro-epigenetica

SINEUP RNAs: una nuova piattaforma per il trattamento dell’aploinsufficienza nei Disturbi dello Spettro Autistico (DSA).

Finanziato da: Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI) – Genomics of ASD: Pathways to Biological Convergence and Genetic Therapies, MUR_PRIN 2022 PNRR, Fondazione Italiana Autismo, bando POC di Ateneo “Road to Market 2025”.  
I Disturbi dello Spettro Autistico (DSA) rappresentano un gruppo altamente eterogeneo di condizioni cliniche, ma con forte componente genetica. La maggior parte delle mutazioni descritte in associazione con i DSA sono mutazioni de novo che causano ridotta espressione o funzionalità proteica (aploinsufficienza). Considerando che generalmente un solo allele è colpito, un potenziale approccio terapeutico consiste nella stimolazione dell’espressione dell’allele non-mutato, ristabilendo così i livelli fisiologici della proteina. Il nostro laboratorio sfrutta la modularità delle molecole SINEUP, una classe di RNA non-codificanti capaci di aumentare selettivamente la traduzione dell’mRNA bersaglio senza però andare a modificare i livelli del trascritto originale.

In un recente studio del nostro laboratorio, abbiamo creato molecole SINEUP sintetiche per bersagliare la proteina Chromodomain helicase DNA-binding 8 (CHD8), uno dei più prominenti fattori di rischio per i DSA. Mediante l’uso di queste molecole di SINEUP-CHD8, siamo riusciti ad aumentare i livelli della proteina endogena CHD8 in cellule umane, in fibroblasti derivati da pazienti e in modelli di zebrafish. Le proteine neo-prodotte sono perfettamente funzionanti e riescono a recuperare fenotipi molecolari associati alla soppressione di CHD8.

Pertanto, sulla base di questi promettenti risultati, ci proponiamo adesso di sviluppare un Proof-of-Concept per lo sviluppo di una terapia - basata su RNA - per il trattamento di patologie causate da aploinsufficienza. Nello specifico:

• Testeremo l’efficacia di SINEUP-Chd8 nel recupero di fenotipi associati alla repressione di Chd8 in vivo, in un modello preclinico murino.
• Estenderemo l'approccio SINEUP ad altri geni di rischio per DSA associati ad aploinsufficienza (ADNP, DYRK1A, GRIN2B, SCN2A, STXBP1, SYNGAP1) utilizzando sia cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti sia modelli ottenuti mediante editing genomico con CRISPR-Cas9.
• Valuteremo la capacità delle SINEUP di recuperare i fenotipi funzionali in neuroni differenziati a partire da questi modelli. In particolare, analizzeremo i profili di espressione genica associati a ciascuna mutazione e la capacità delle SINEUP di correggere le alterazioni trascrizionali osservate. Infine, per le SINEUP più promettenti, approfondiremo lo studio di fenotipi funzionali specifici associati alle singole mutazioni.
• Valuteremo il potenziale terapeutico delle SINEUP nelle condizioni di aploinsufficienza di CHD2, una patologia di rilevanza clinica caratterizzata da epilessia, autismo e disabilità intellettiva. Gli studi combineranno analisi in vitro delle alterazioni trascrizionali, epigenetiche, proteomiche e funzionali con la valutazione in vivo del recupero dei fenotipi comportamentali e neurofisiologici in un modello murino di aploinsufficienza di Chd2.

Disfunzioni telomeriche nei Disturbi dello Spettro Autistico

I telomeri, strutture specializzate che "proteggono" le estremità dei cromosomi eucariotici, svolgono un ruolo cruciale nella replicazione del DNA e nel mantenimento dell'integrità del genoma. Variazioni nella lunghezza dei telomeri (TL) o nella loro integrità sono chiaramente associate a processi patologici, non solo a diverse forme di tumore ma anche a disturbi neuropsichiatrici. In particolare, recenti studi hanno evidenziato alterazioni della lunghezza telomerica in pazienti con DSA. L'integrità dei telomeri è regolata da TERRA, una classe di RNA non codificanti (ncRNA) trascritti dalle regioni subtelomeriche e che si estendono nelle sequenze telomeriche. L'abbondanza dei TERRA è strettamente correlata alla stabilità dei telomeri e, di conseguenza, all'integrità cromosomica. Di particolare interesse sono i regolatori della cromatina appartenenti alla famiglia delle proteine Chromodomain Helicase DNA-binding (CHD8, CHD2, CHD1 e CHD3), tutti importanti fattori di rischio per i DSA e noti per interagire con i TERRA. Nel loro insieme, queste osservazioni suggeriscono un aspetto biologico finora poco esplorato nei DSA: una potenziale interazione funzionale tra TERRA, telomeri e fattori di rischio per DSA. La disregolazione di questa rete potrebbe essere associata ad alterazioni della lunghezza dei telomeri e a una compromissione dell'integrità genomica, processi rilevanti per i DSA che potrebbero aprire nuove prospettive per lo sviluppo di strategie terapeutiche.

Approcci genetici allo studio della Malattia di Huntington (HD): fenotipi negletti e potenziali nuovi modulatori della malattia

La Malattia di Huntington è una patologia ereditaria autosomica dominante causata dall'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche CAG nell'esone 1 del gene HTT. Il processo patologico è principalmente associato alla progressiva degenerazione dei neuroni striatali e corticali, che conduce inevitabilmente al decesso del paziente.

Il Sistema Nervoso Enterico (ENS) nella Malattia di Huntington

Finanziato da European Huntington’s Disease Network (EHDN).

Sebbene i fenotipi a carico del sistema nervoso centrale nella Malattia di Huntington (HD) siano ben documentati, un ampio spettro di sintomi periferici altamente debilitanti, quali la perdita di peso involontaria e le disfunzioni gastrointestinali (GI), rimane ancora poco caratterizzato, nonostante il loro significativo impatto sulla qualità di vita dei pazienti. Il sistema nervoso enterico (ENS), costituito da oltre una dozzina di differenti sottotipi neuronali, regola importanti funzioni gastrointestinali, tra cui motilità, secrezione, digestione e peristalsi. Alterazioni della funzione dell'ENS possono determinare disfunzioni gastrointestinali, inclusa la disfagia, associata a un aumentato rischio di polmonite, una complicanza frequentemente fatale nei pazienti affetti da HD. In questo studio ci proponiamo di caratterizzare le alterazioni gastrointestinali associate alla disfunzione del sistema nervoso enterico (ENS), utilizzando il modello murino transgenico zQ175.  Nello specifico, ci occuperemo di:

• fornire una caratterizzazione anatomica completa delle potenziali alterazioni del sistema nervoso enterico (ENS);
• valutare la funzionalità gastrointestinale (GI);
• eseguire analisi a singola cellula per caratterizzare le alterazioni trascrizionali nei neuroni enterici e nelle cellule gliali.

Alterazioni degli RNA circolari (circRNA) nella patogenesi della Malattia di Huntington (HD)

La regolazione dello splicing alternativo è fondamentale non solo per generare il repertorio di isoforme di RNA che codificano proteine essenziali per il corretto mantenimento delle funzioni cellulari, in particolare nei neuroni, ma anche per la biogenesi degli RNA circolari (circRNA). Questi RNA non codificanti, particolarmente resistenti alla degradazione, sono prodotti attraverso un processo di back-splicing che determina la circolarizzazione degli esoni e risultano particolarmente abbondanti nei neuroni. Negli ultimi anni è emersa con sempre maggiore evidenza la loro importanza come regolatori della fisiologia cellulare, dello sviluppo e dei processi patologici.

• Il nostro laboratorio ha identificato e validato sperimentalmente il primo RNA circolare derivato dal locus HTT, denominato circHTT (2,3,4,5,6). circHTT è arricchito nel sistema nervoso centrale ed è conservato in diverse specie di mammiferi. La sua natura circolare è stata validata mediante l'utilizzo di primer divergenti, sequenziamento e trattamento con RNase R. L'espressione di circHTT/circHtt aumenta significativamente con l'espansione delle ripetizioni CAG, sia nei neuroni terminalmente differenziati sia in diverse regioni cerebrali di differenti modelli murini di HD. Il nostro obiettivo è caratterizzare le dinamiche temporali e spaziali dell'espressione di circHtt e approfondirne le funzioni cellulari e molecolari nel sistema nervoso, nonché il suo potenziale ruolo nella fisiopatologia della Malattia di Huntington. Finanziato da Hereditary Disease Foundation (HDF), the Telethon foundation, RAPID (MUR_PNRR_M4C2_Inv 1.4_CN_BaC_CN RNA & GT_Spoke 3 IIT), European Molecular Biology Organization (EMBO postdoctoral fellowship to Jasmin Morandell, ALTF 897-2021) e dall’Unione Europea (MSCA postdoctoral fellowship to Jasmin Morandell, GA n° 101062297 — BrainCircHD)
• A completamento dei nostri studi, analizziamo campioni di sangue di pazienti affetti da Malattia di Huntington e di controlli sani per studiare le alterazioni sistemiche del trascrittoma, dello splicing e del back-splicing. Il nostro obiettivo è caratterizzare le alterazioni molecolari nei diversi stadi della malattia e identificare eventuali differenze associate al sesso. Parallelamente, analizziamo e quantifichiamo i circRNA per valutarne il potenziale come biomarcatori ematici affidabili. Finanziato da Huntington’s Disease Society of America.