Next Generation Sequencing (NGS)
La NGS Core Facility del Dipartimento CIBIO è un Laboratorio tecnologico gestito da Staff Scientist del DiCIBIO dell’Università di Trento. Il nostro obiettivo è quello di offrire una tecnologia all’avanguardia ai nostri utenti e consegnare dati e analisi di alta qualità ai nostri collaboratori.
La tecnologia Next-Generation sequencing ha avuto e ha tuttora un grande potenziale per permettere nuove scoperte in molte delle varie discipline biologiche e mediche. Questa tecnologia consente il sequenziamento massivo e parallelo di frammenti di acidi nucleici ed è applicabile in una varietà di quesiti sperimentali, tra cui il ri-sequenziamento di genomi, il rilevamento di SNP e di varianti strutturali, la misurazione dei livelli di trascrizione degli RNA e una pletora di altre applicazioni.
La nostra struttura utilizza i sequenziatori Illumina NovaSeq6000 e MiSeq e 2 MinION della Oxford Nanopore Technology.
Il NovaSeq6000 di Illumina offre un output fino a 6 Tb e 20 miliardi di letture (reads) in meno di 2 giorni e la capacità di utilizzare una o due flowcell con diversa chimica, contemporaneamente. Ciò fornisce una piattaforma flessibile e scalabile che supporta una ampia gamma di applicazioni e diverse dimensioni di analisi.
Il MiSeq di Illumina può essere utilizzato per una varietà di applicazioni mirate, come studi pilota per il controllo di qualità di ampi progetti NovaSeq, metagenomica, sequenziamento di piccoli genomi come campioni microbici o virali, espressione genica mirata o sequenziamento di pannelli di geni. Il processo di Sequenziamento su Miseq per alcuni test per diagnostica è accreditato dalla norma UNI EN ISO 15189:2013 (MED n. 0013).
Il MinION della Oxford Nanopore Technology è un dispositivo portatile per il sequenziamento di DNA e RNA a singola molecola e in tempo reale.
La stretta collaborazione con i ricercatori della nostra Università e di altri enti di ricerca ci ha permesso di sviluppare e rendere disponibili altre applicazioni personalizzate su queste piattaforme.
Attualmente offriamo la preparazione delle librerie come servizio per alcune applicazioni di RNA e DNA sequencing e facilitiamo, attraverso una consulenza tecnologica e scientifica, la progettazione sperimentale di progetti NGS, fornendo consigli su molti protocolli di preparazione delle librerie ed eseguendo controlli di qualità (QC) sulle librerie prodotte esternamente alla NGS Core Facility.
Per poter procedere con il QC delle librerie prodotte esternamente dobbiamo ricevere come minimo 20μl di libreria di DNA a una concentrazione di 20nM (volumi e concentrazioni maggiori sono sempre preferibili, contattaci se doveste avere concentrazioni minori).
È necessario comunicarci il peso molecolare medio dei frammenti (effettuato da un BioAnalyzer o una macchina equivalente) e la concentrazione in ng/μl (definita utilizzando un Qubit o un test simile, NON Nanodrop) attraverso i form scaricabili nella finestra a destra. È responsabilità dei ricercatori fornire informazioni corrette: le analisi di QC saranno comunque addebitabili. Se i requisiti QC iniziali delle librerie non verranno soddisfatti, i ricercatori saranno informati via e-mail.
È possibile inviare nuovamente campioni di qualità e quantità adeguati oppure procedere nel sequenziamento con i campioni non soddisfacenti il nostro QC. In questo secondo caso, i campioni verranno caricati per il sequenziamento ma la qualità dei dati prodotti non sarà garantita e i ricercatori dovranno pagare il sequenziamento in ogni caso.
La NGS Core Facility prende in gestione i campioni nell'ordine in cui vengono ricevuti nel nostro laboratorio. Per utilizzare gli strumenti nel modo più efficace e ridurre al minimo i costi per gli utenti, proviamo sempre a raccogliere la quantità di campioni utile a riempire completamente una flowcell prima di iniziare un'analisi. Gli Utenti che non vorranno attendere l'accumulo del set completo di campioni avranno la possibilità di accelerare il servizio accettando di pagare il costo della intera flowcell.
- La co-authorship è sempre prevista quando il personale della struttura ha apportato contributi significativi al progetto di ricerca sotto forma di consulenza, progettazione sperimentale, sviluppo di metodi o analisi e interpretazione dei dati. In tali casi, il personale della struttura deve avere la possibilità di rivedere e modificare il manoscritto prima dell'invio.
- Gli aknowledgements dei contributi della NGS Core Facility intera o di singoli staff scientist sono sempre dovuti nelle pubblicazioni che includono dati generati nella struttura anche quando viene eseguito un servizio a pagamento. Un esempio di riconoscimento appropriato è “Gli autori desiderano ringraziare la NGS Core Facility del CIBIO dell'Università di Trento per il sequenziamento dei campioni”.
Vi preghiamo di informarci quando le pubblicazioni verranno accettate e di inoltrarcene una copia per i nostri archivi. Queste informazioni sono fondamentali per il continuo supporto della struttura.
La consegna dei dati avverrà attraverso la piattaforma BASESPACE della azienda Illumina. Sarà necessario per l’utente attivare un account basic Basespace. Gli Utenti sono responsabili della conservazione dei dati una volta consegnati dalla NGS facility sulla piattaforma BASESPACE. Dopo 1 mese dalla consegna dei dati la run di sequenziamento presente nel nostro Storage sarà eliminata, senza necessità di ulteriore comunicazione.
La NGS Core Facility consiglia vivamente i ricercatori di effettuare copie di backup dei propri dati.
Veronica De Sanctis
Roberto Bertorelli