La Facility di microscopia ottica avanzata (AICF) offre accesso a una vasta collezione di microscopi ottici all'avanguardia, permettendo agli utenti di spaziare dalle osservazioni di base con luce trasmessa alle tecniche avanzate di imaging in fluorescenza in vivo. Il personale della Facility fornisce supporto tecnico e scientifico specializzato in ogni fase degli esperimenti di imaging, dalla progettazione sperimentale all'acquisizione delle immagini, fino all'elaborazione e all'analisi dei dati.

Applicazioni e servizi della Facility

Tecniche di microscopia offerte dalla Facility:

• Microscopia wide-field in luce riflessa (epi-fluorescenza).
• Microscopia wide-field in luce trasmessa, con i seguenti metodi di contrasto: campo chiaro, campo scuro, contrasto di fase e contrasto interferenziale differenziale (DIC).
• Sezionamento ottico wide-field con illuminazione strutturata.
• Microscopia confocale a scansione laser e spinning disc.
• Microscopia multifotone, che permette di penetrare fino a circa 1 mm di profondità in campioni 3D (tessuti, organi, organoidi, piccoli animali modello).
• FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) sia in modalità confocale a scansione laser a singolo fotone, sia in modalità multifotone. Questa tecnica si basa sulla misura del tempo di decadimento della fluorescenza di un fluoroforo, permettendo, ad esempio, l’utilizzo di biosensori (per lo studio dell’attività metabolica, dei meccanismi di signaling, delle modifiche al pH e microambiente), la separazione di fluorofori sovrapposti e la separazione del contributo dell’autofluorescenza.
• Esperimenti di λ-scan eccitazione / λ-scan emissione, fondamentali per caratterizzare campioni incogniti e/o contenenti fluorocromi non standard.
• Rilevazione di segnali non lineari come Second Harmonic Generation (SHG), per imaging senza marcatori di strutture come collagene o fibre tissutali.
• Time-lapse e in-vivo imaging in fluorescenza e in campo chiaro con sistemi di incubazione che consentono il controllo delle condizioni ambientali per lunghi periodi.
• Imaging in fluorescenza e campo chiaro su grandi aree (mosaici/tile-scan) per campioni di grandi dimensioni (come sezioni di cervello di topo o preparazioni istologiche).
• Microscopia in super-risoluzione:
  • PALM (PhotoActivated Localization Microscopy), basata sulla attivazione stocastica di fluorofori fotoattivabili, e dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), che sfrutta fluorofori convenzionali portati in stati “on/off” tramite buffer chimici riducenti; per studi di distribuzione e clustering di proteine di membrana, conteggio di molecole singole in complessi proteici, architettura subcellulare nanometrica (pori nucleari, cromatina, citoscheletro, sinapsi) e imaging di vescicole extra-cellulari.
  • SIM (Structured Illumination Microscopy), basata su illuminazione strutturata e ricostruzione matematica dell’immagine; per studi di dinamiche del citoscheletro, mitosi, traffico vescicolare e organelli intracellulari.
  • TIRF-SIM (Total Internal Reflection Fluorescence SIM), che combina eccitazione confinata a ~100 nm dalla superficie con illuminazione strutturata, migliorando la risoluzione nel piano della membrana; per studi di adesioni focali, esocitosi/endocitosi, dinamica recettoriale e sinapsi.
• FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), per studi di mobilità, diffusione laterale di proteine di membrana, turnover proteico e dinamica del citoscheletro.
• FRET (Förster Resonance Energy Transfer) e single-molecule FRET (smFRET), per studi di interazioni proteina-proteina, cambi conformazionali, biosensori intracellulari.
• Single-Particle Tracking (SPT), per diffusione di recettori di membrana, trasporto intracellulare, dinamica virale.
• TIRF e HILO (Highly Inclined and Laminated Optical sheet) illumination, per eventi di membrana (endocitosi, esocitosi, adesioni focali) e dinamica recettoriale.
• Microdissezione laser a livello di singola cellula (su campioni fissati e cellule vive in coltura).

Servizi offerti dal personale della Facility:

• Supporto tecnico e scientifico nella progettazione sperimentale.
• Supporto tecnico nell'acquisto e nella configurazione dei microscopi.
• Training per l'uso autonomo dei microscopi.
• Affiancamento al microscopio per utenti non autonomi.
• Servizio di acquisizione immagini.
• Servizio di analisi delle immagini, scrittura di pipeline di analisi automatizzate e servizio di analisi e interpretazione dei dati usando software come ImageJ/Fiji, QuPath, SVI Huygens Core e Essential (per deconvoluzione), Leica LasAF/LasX, Zeiss ZEN e Nikon NIS Elements.

Attrezzature della Facility

Sistemi wide-field

• Microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti2 E completamente motorizzato, dotato di sorgente laser a linee multiple Lumencor CELESTA, due camere digitali monocromatiche (una sCMOS Andor Zyla 4.2 Plus e una EMCCD Andor iXon 888) e sistema di incubazione Okolab per osservazioni su cellule vive.
• Microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti2 E completamente motorizzato, dotato di sorgente LED multi-linea Nikon D-LEDI e camera digitale monocromatica sCMOS Hamamatsu ORCA Flash 4.0.
• Microscopio rovesciato Leica DMi8 completamente motorizzato, equipaggiato con LED bianco Lumencor Sola e camera monocromatica sCMOS Andor Zyla 4.
• Microscopio rovesciato Zeiss Axio Observer Z1 completamente motorizzato, equipaggiato con due sorgenti luminose (LED multicolore Colibri 2 e lampada a fluorescenza metal halide HXP 120), modulo ApoTome 2 per illuminazione strutturata, camera monocromatica AxioCam 503 mono D e incubatore Pecon per osservazioni su cellule vive.
• Microscopio dritto Zeiss Axio Imager M2 completamente motorizzato, dotato di lampada a fluorescenza metal halide HXP 120, camera monocromatica sCMOS Zeiss Axiocam 305 e camera a colori sCMOS Zeiss Axiocam 705. 

Sistemi confocali e multifotone

• Sistema confocale a scansione laser Leica STELLARIS 8, su microscopio rovesciato Leica DMi8 CS Premium dotato di sistema di incubazione Okolab, integrato con unità multifotone DIVE. Entrambe le modalità sono disponibili con i moduli FALCON (FAst Lifetime CONtrast) e TauSense per acquisizioni in modalità FLIM.

  • Configurazione del sistema confocale a scansione laser: laser bianco a singolo fotone (sorgente pulsata con emissione nell'intervallo 440-790 nm), laser a singolo fotone con emissione a 405 nm, beam splitter opto-acustico (AOBS), sistema di scansione di tipo galvanometrico, detector fotomoltiplicatore (PMT) per la rilevazione del segnale in luce trasmessa e due detector Power HyD S e un detector Power Hyd X, basati su prisma, per la rilevazione del segnale in luce riflessa. Il software Leica LAS X include moduli per FRET, FRAP e il pacchetto di deconvoluzione proprietario (Lightning).
  • Configurazione del sistema multifotone DIVE: eccitazione a due fotoni con laser infrarosso a luce pulsata tunabile nel range 680-1080 nm, sistema di rilevazione spettrale 4Tune dotato di 2 detector spettrali non descansiti (un detector Power Hybrid e un PMT).
• Sistema confocale a scansione laser Leica TCS SP8 su microscopio rovesciato Leica DMi8, dotato di: banco laser a linee multiple, un detector PMT HyD e tre detector PMT convenzionali, oltre a un detector per la luce trasmessa. La separazione dei canali è realizzata tramite un detector spettrale a prisma. Il software Leica LAS X include moduli per FRET, FRAP e il pacchetto di deconvoluzione proprietario (Lightning).
• Sistema confocale a scansione laser Nikon AX su un microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti2 E equipaggiato con: banco laser a linee multiple, due detector GaAsP ultra-sensibili e due detector PMT convenzionali, oltre a un detector per la luce trasmessa. La separazione dei canali è realizzata tramite filtri di emissione. Il software Nikon AR include il modulo di deconvoluzione proprietario di Nikon (NIS.ai).
• Sistema CREST X-light V3 Spinning Disc basato su un microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti E equipaggiato con: banco laser a linee multiple CELESTA, due camere digitali monocromatiche (una sCMOS Andor Zyla 4.2 e una EMCCD Andor iXon 888) e un sistema di incubazione Okolab per osservazioni su cellule vive. Il software Nikon AR include il modulo di deconvoluzione proprietario di Nikon (NIS.ai).

Sistemi a super-risoluzione

• Sistema Nikon N-SIM S su un microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti2 E, dotato di: banco laser a linee multiple e camera digitale monocromatica sCMOS Hamamatsu ORCA Flash 4.0. Il software Nikon AR include i moduli necessari per la ricostruzione matematica della immagini acquisite in modalità 2D, 3D e 2D-TIRF SIM.
• Sistema rovesciato ONI Nanoimager equipaggiato con laser a linee multiple e LED come sorgenti luminose, e camera digitale monocromatica sCMOS Hamamatsu ORCA Flash 4.0. Tecniche disponibili: wide-field, TIRF, HILO (Highly Inclined and Laminated Optical sheet), dSTORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM (Photoactivated Localization Microscopy), Single-particle tracking (SPT), Single-molecule FRET (smFRET), SIM basata su DMD e microscopia confocale.

Sistema di microdissezione laser

• Sistema di microdissezione laser Leica LMD6500 basato su un microscopio rovesciato Leica DM6000 B.

Stereomicroscopi

Stereomicroscopi a fluorescenza manuali Leica MZ 10F, 16F e Leica S9i.

Strumenti per la preparazione di campioni istologici

• Criostato Leica CM 1850 UV.
• Criostato Thermo Scientific HM525 NX.
• Microtomo Leica HistoCore Biocut.
• Vibratomo Leica VT 1200.
• Processore automatico di tessuti Histo-Line HistoPro200.
• Centralina di inclusione in paraffina Histo-Line TEC 2900.